Gd200组织研磨仪在动物基因组DNA提取中的应用
在分子生物学领域,提取高质量的基因组DNA是试验成功的前提,那么如何提取高质量的基因组DNA,下面就将介绍动物组织基因组总DNA提取的一种方法,包括实验原理、实验步骤、注意事项以及常见问题解析。
1.实验材料
动物组织或培养的细胞，液氮，裂解缓冲液，3mol/L的NaAc溶液（pH5.2), 70% 及100%的乙醇，TE溶液（pH 8.0)，25:24:1的苯酚/氯仿/异丙醇，冰上预冷的PBS (样本为细胞才需要），水浴锅或温箱（调至50℃）。
2.实验步骤
2.1.样本处理
2.1.1.动物组织
方法一：手工裂解
(1) 切取一小块组织（0.2~1.0 g,尽量去除纤维结缔组织）并称重，尽量剪碎后放入研钵。
(2) 加入少量液氮使研钵及组织初步冷冻，然后用枪头或小木棒移动一下组织，防止其黏在研钵上。
(3) 再次加入液氮，使组织尽可能冻脆，然后在液氮即将挥发完的时候开始迅速研磨。
(4) 将组织粉末倒入装有裂解缓冲液（每100mg组织1.2mL)的离心管中。
方法二：GD200组织研磨仪自动裂解
(1) 切取一小块组织（0.2~1.0 g,尽量去除纤维结缔组织）并称重，尽量剪碎后放入2ml离心管。
(2) 加入少量裂解子到离心管，并将离心管放到冷冻适配器中。
(3) 将冷冻适配器放入到液氮罐内冷冻。
(4)将冷冻适配器放置到GD200研磨仪，按转速2000RPM，研磨2分钟
(5) 将有裂解缓冲液（每100mg组织1.2mL)的加入到离心管中。
2.1.2.培养细胞
(1) 将细胞粗略计数后收集至离心管，5℃ 500 g离心5 min,去上清。
(2) 加入等量预冷的PBS吹打匀后，5℃ 500 g离心5min，弃上清。
(3) 重复（2）步一次。
(4) 每108个细胞加入1mL裂解缓冲液（最少0.3mL）
2.2.消化
将上述离心管盖紧后放置于50℃水浴锅或温箱中（有条件可轻微摇动）。12〜18 h 后溶液应呈黏稠状。
2.3.核酸抽提
(1) 加入与水相等体积的饱和酚/氯仿/异丙醇溶液，并上下倒置混匀。1700g离心 5 min。 (2) 将上层水相小心吸出至另一新离心管中。 (3) 重复上述的两步。 (4) 加入0.1倍体积的3 mol/L的NaAc溶液及2倍体积的100%乙醇，轻轻转动离心管至溶液混匀，-20℃放置10〜20 min，DNA沉淀形成白色丝状物。 (5) 用玻棒挑出DNA沉淀，70%乙醇中漂洗并晾干后，加入TE溶液（每0.1g组织或108个细胞加0.2 mL)，彻底溶解后-20℃保存。
3.关键因素
(1)如果样品是肝组织，注意在取材的时候不要被胆囊污染，因为其中含有大量消化酶。
(2)第一次加入液氮时不能太多，防止组织紧紧黏附在研钵上，影响研磨；第二次加入液氮要比较多，使组织尽可能冻硬冻脆，才能研磨粉碎，而且动作要迅速，防止DNA被降解。
(3)蛋白质一定要去除干净，防止其干扰后续的酶切，必要时重复用蛋白酶K消化。
(4)用酚/氯仿抽提时应避免剧烈振荡，防止基因组DNA断裂成小片段。
(5)第二次酚/氯仿抽提时应避免吸到下层的有机相。
(6)70%乙醇漂洗完后应尽可能晾干，以免抑制后续反应。
(7)要避免对高分子量DNA的剪切，可将最后上层的水相DNA溶液用TE缓冲液作两次透析，每次24h以上。以除去有机溶剂和盐。
(8)除去残留的RNA，加入0.1%的SDS和1μg/mL无DNA酶的RNase，37℃温育1h，重复核酸抽提的步骤。
(9)最后一步溶解DNA沉淀时可置于65℃帮助溶解。
4.常见问题
(1)有机相与水相不能均匀分开，一般是由于DNA浓度太高或还残留着大量细胞的残存成分。此时应加入适量裂解缓冲液稀释。
(2)最后如果没有DNA出现，则将溶液与2000g离心3min。若还无DNA，则可能由于之前没有消化完全，可以适当增加裂解缓冲液的量。也有可能是DNA在某一步中已被降解。
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